細(xì)胞生長(zhǎng)的檢查方法（一）

1.直接計(jì)數(shù)法

是zui簡(jiǎn)單的檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。計(jì)數(shù)細(xì)胞一般利用臺(tái)盼藍(lán)(錐蟲藍(lán)染色，臺(tái)盼藍(lán)(錐蟲藍(lán))不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色。而死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而使細(xì)胞著色。因此，鏡下未染色細(xì)胞認(rèn)為是活細(xì)胞，而染色細(xì)胞認(rèn)為是死亡細(xì)胞。

經(jīng)典的細(xì)胞計(jì)數(shù)常用到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液加入血蓋片和計(jì)數(shù)板之間的空隙中，通常我們計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板的四角大方格(每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計(jì)完數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計(jì)數(shù)板中每一方格的面積為0. 01cm²，高為0. 01cm，這樣它的體積為0. 0001cm³，即0.1mm³。由于1ml=1000mm³，所以每一大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)×10 000=細(xì)胞數(shù)／ml，可按下式計(jì)算：細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)／ml=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)／4×10000。如計(jì)數(shù)前己稀釋，可再乘稀釋倍數(shù)。計(jì)數(shù)細(xì)胞后，可以根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，以天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

目前也有多家公司生產(chǎn)自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，如lifetechnology、Bio-rad等公司。自動(dòng)計(jì)數(shù)儀將圖像輸入電腦后自動(dòng)計(jì)數(shù)，消除了手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的主觀性，消除了用戶之間的差異性，可以快速準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)細(xì)胞，并同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞存活率及平均大小。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，有公司也推出了直接計(jì)數(shù)細(xì)胞的分析儀器，如Roche旗下Innovatis公司的CASY系列細(xì)胞計(jì)數(shù)分析系統(tǒng)，CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)儀采用*的電脈沖三維掃描分析技術(shù)。它突破了傳統(tǒng)二維細(xì)胞成像分析技術(shù)和染色法的局限，提供更加的細(xì)胞計(jì)數(shù)和分析功能。無需購買染色劑，即可、快速地定量細(xì)胞濃度、體積、成團(tuán)和碎片。它根據(jù)測(cè)量的體積來計(jì)算細(xì)胞成團(tuán)，即使是嚴(yán)重成團(tuán)的細(xì)胞，它也能正確定量。細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)破損，CASY測(cè)得的是細(xì)胞核的體積，根據(jù)體積大小的差別，我們可以區(qū)分活細(xì)胞、死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片。

2.檢測(cè)DNA合成

檢測(cè)DNA合成是目前檢測(cè)細(xì)胞增殖zui準(zhǔn)確可靠的方法，目前常用的方法有如下幾種：

(1)³H-胸腺嘧啶核苷滲入法(³H-TdR)：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA合成的前體物，處于S期的細(xì)胞不斷地?cái)z取TdR用以合成DNA。³H-TdR摻入法是將被放射性標(biāo)記的³H-TdR摻入DNA合成期的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)³H-TdR摻入量的多少可客觀反映細(xì)胞復(fù)制DNA能力的大小，從而問接了解細(xì)胞增殖情況。通過檢測(cè)。H放射活性即可反映DNA含量。

1976年Mattem等首先采用此方法做體外藥敏試驗(yàn)。此后經(jīng)過長(zhǎng)期的廣泛研究，也己證實(shí)該法對(duì)各種動(dòng)物腫瘤及人類腫瘤均有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值和重復(fù)性，主要用于細(xì)胞增殖的檢測(cè)與藥物敏感性試驗(yàn)等。但這種方法操作復(fù)雜，試劑含有同位素，具有放射性，對(duì)實(shí)驗(yàn)者有一定的危害，故限制了它的應(yīng)用。

(2)BrdU檢測(cè)法：BrdU中文全名為5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)摻入，而后利用抗BrdU的抗體耦聯(lián)不同的酶，加入不同發(fā)光特性的底物，然后再通過比色法、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)或熒光信號(hào)檢測(cè)底物強(qiáng)度等步驟，反映BrdU的摻入量。該方法不需要再和放射性物質(zhì)打交道。

(3)EdU檢測(cè)法：BrdU雖然解決了接觸同位素的問題，但該方法需要變性DNA后才能與抗體結(jié)合，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)某些后續(xù)或同時(shí)進(jìn)行的試驗(yàn)，如其他染料的結(jié)合染色有影響?，F(xiàn)在有一種新的檢測(cè)方法能避免這種情況的發(fā)生——EdU檢測(cè)。EdU(5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，但其連有的炔羥基團(tuán)在天然化合物中很少見，在細(xì)胞增殖時(shí)能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中，基于EdU與染料的共軛反應(yīng)可以進(jìn)行快速的細(xì)胞增殖檢測(cè)分析，可以有效地檢測(cè)處于S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測(cè)方法相比，更簡(jiǎn)單，更快速，更準(zhǔn)確。