章魚(yú)肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制（一）

  章魚(yú)肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品。以章魚(yú)加工副產(chǎn)物為原料， 通過(guò)提取、 分離純化制備高純章魚(yú)肉堿， 采用紅外光譜(IR)、 高分辨質(zhì)譜 (MS) 和核磁共振譜 (NMR) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。樣品分裝成 144 瓶， 采用離子色譜檢測(cè)法進(jìn)行均勻性、 穩(wěn)定性檢驗(yàn)和定值分析。從樣品中隨機(jī)抽取 15 瓶進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)， 經(jīng) F 檢驗(yàn)表明： 在 95% 的置信區(qū)間內(nèi)樣品均勻性良好。在 0～4℃條件下， 經(jīng)過(guò) 24 個(gè)月長(zhǎng)期試驗(yàn)穩(wěn)定性考察， 結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性良好。標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)國(guó)內(nèi) 8 家具有分析資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同定值， 章魚(yú)肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果為 99.49%， 相對(duì)擴(kuò)展不確定度為 0.14%(k=1.96)。該標(biāo)準(zhǔn)樣品達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)要求， 可用于章魚(yú)肉堿相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和分析方法校正。

  Development of Octopine Certified Reference Material

  Octopine certified reference material was developed. Octopine was made from the processing byproduct of octopus. The structure of octopine certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy (IR)， high resolution mass spectral (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). Octopine was divided into 144 bottles. The homogeneity and stability testing and quantitative analysis method were evaluated by ions chromatography. According to analysis procedure of homogeneity， 15 bottles of sample were randomly taken from 144 bottles， the sample homogeneity of inspection validated by F–test statistical methods within the 95% confidence interval was good. The stability inspection was carried on the long-term(24 months)， and the results indicated that the period for octopine of storage was 24 months at 0 – 4℃ . A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of octopine was 99.49% with the relative expaned uncertainty of 0.14 % (k=1.96). The reference material can conform to the technical requirement of the certified reference material. The material was intended for use in the method validation and quality control regarding octopine.

  章魚(yú)肉堿 (Octopine) 又名章魚(yú)堿， 在自然界中主要存在于章魚(yú)、 烏賊、 魷魚(yú)、 扇貝等海產(chǎn)軟體動(dòng)物中， 由精氨酸與丙氨酸或丙酮酸在酶的作用下縮合而成， 具有重要的生物活性功能。研究發(fā)現(xiàn)， 章魚(yú)肉堿是導(dǎo)致章魚(yú)、 扇貝等味道鮮美的原因之一； 章魚(yú)肉堿有助于降低小鼠血液中總膽固醇和VLDL， LDL 膽固醇的水平， 同時(shí)增加小鼠血液中HDL 膽固醇水平； 對(duì)比研究揭示喂食章魚(yú)肉堿可顯著提高小白鼠的交尾次數(shù)及妊娠概率。 此外，章魚(yú)肉堿還是一種表征品質(zhì)和新鮮度的指示劑，可以應(yīng)用于食品質(zhì)量監(jiān)控及安全等方面。目前， 國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)章魚(yú)肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的報(bào)道。筆者以章魚(yú)加工副產(chǎn)物為原料， 通過(guò)提取、 分離純化獲得高純章魚(yú)肉堿單體， 研制了標(biāo)準(zhǔn)樣品， 為深入開(kāi)展相關(guān)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

  1. 實(shí)驗(yàn)部分

  1.1  主要儀器與試劑

  離子色譜儀： Dionex ICS–3000 型， 配備積分脈沖安培檢測(cè)器， 美國(guó) Dionex 公司；

  紅外光譜儀： Bruker VERTEX 70 型，美 國(guó)Bruker 公司；

  高分辨質(zhì)譜儀： Q–Tof micro 型， 美國(guó) Waters 公司；

  核磁共振儀： Bruker 400 MHz 型， 美國(guó) Bruker公司；

  天平： AL／104 型， 瑞士梅特勒 – 托利多集團(tuán)；

  鹽酸、 醋酸鈉、 氫氧化鈉： 分析純；

  實(shí)驗(yàn)用水來(lái)自 Milli-Q 純水系統(tǒng)。

  1.2  章魚(yú)肉堿樣品的制備

  以章魚(yú)加工副產(chǎn)物為原料， 經(jīng)浸提、 膜分離等步驟后獲得粗品， 再采用色譜分離、 濃縮、 干燥等精制方法獲得純度不小于 99% 的章魚(yú)肉堿。

  1.3  定性與定值分析

  采用紅外吸收光譜、 高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜等對(duì)章魚(yú)肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。采用離子色譜法對(duì)章魚(yú)肉堿樣品定值檢測(cè)。

  1.4  色譜條件

  色譜柱： Dionex AminoPac PA–10柱(250 mm×2mm， 10 µm，美 國(guó) Dionex 公 司 ) ；柱 流 量： 0.24mL／min ； 柱溫： 30℃； 進(jìn)樣體積： 25 µL ； 流動(dòng)相：A 為 水， B 為 250 mmol／L NaOH 溶 液， C 為 1.0mol／L NaOAc， 進(jìn)行梯度洗脫， 洗脫程序見(jiàn)表 1。

  1.5  樣品溶液配制

打開(kāi)章魚(yú)肉堿樣品瓶蓋子后， 精密稱(chēng)取章魚(yú)肉堿適量， 用超純水配制成章魚(yú)肉堿質(zhì)量濃度約為 8µg／mL 的溶液， 按照 1.4 色譜條件進(jìn)行純度檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣 3 次。

  1.6  均勻性檢驗(yàn)

  按照 GB／T 15000.3–2008規(guī)定， 本項(xiàng)目確定抽樣數(shù)目為 15 個(gè)， 采用單因素多水平試驗(yàn)方差分析法對(duì)章魚(yú)肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)， 測(cè)定方法采用上述的離子色譜檢測(cè)法， 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3 次。檢測(cè)數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性是否合格。

  1.7  穩(wěn)定性檢驗(yàn)

  為了考察樣品的穩(wěn)定性， 確定其有效期， 取本標(biāo)準(zhǔn)樣品模擬上市包裝， 進(jìn)行 0～4℃條件下的 24 個(gè)月長(zhǎng)期試驗(yàn)， 分別于 0， 3， 6， 9， 12， 18， 24 個(gè)月末取樣檢測(cè)， 通過(guò)考察標(biāo)準(zhǔn)樣品純度的變化來(lái)研究樣品的穩(wěn)定性。采用上述離子色譜檢測(cè)法， 每份樣品連續(xù)進(jìn)樣 2 次， 然后用歸一法求出其純度的平均值。